John Edmund Mulaney tam adıyla, 26 Ağustos 1982 tarihinde Chicago, Illinois’de dünyaya geldi. Ailesi İrlandalı Katolik kökenli olan Mulaney’in annesi Northwestern Üniversitesi Pritzker Hukuk Fakültesi'nde profesördü. Mulaney, genç yaşta gösteri dünyasına ilgi duymaya başladı ve yedi yaşında "The Rugrats" adlı çocuk skeç grubuna katıldı. Georgetown Üniversitesi'nde İngilizce okurken, Nick Kroll ve Mike Birbiglia ile tanıştı ve bu ilişki stand-up kariyerine adım atması için kendisine  destek oldu.

Mulaney, 2008-2013 yılları arasında NBC'nin ünlü skeç programı Saturday Night Live'da yazar olarak çalıştı ve Stefon karakterini Bill Hader ile birlikte yarattı. Stand-up gösterileri arasında "The Top Part" (2009), "New in Town" (2012), "The Comeback Kid" (2015), "Kid Gorgeous" (2018) ve "Baby J" (2023) gibi işler sayılabilir. "Kid Gorgeous" ve "Baby J" özel gösterileri ile iki Primetime Emmy Ödülü kazandı. Ayrıca, "John Mulaney & the Sack Lunch Bunch" (2019) adlı çocuk müzikali komedi özel gösterisi olarak Netflix'te yayınlandı.

Mulaney, Fox'ta kısa ömürlü yarı otobiyografik sitcom "Mulaney" (2014–2015) ile tanındı ve Nick Kroll ile "Oh, Hello on Broadway" adlı komedi gösterisinde George St. Geegland karakterini canlandırdı. Ayrıca, IFC'nin "Documentary Now!" (2015–günümüz) adlı sahte belgesel dizisinde yapımcı ve yazar olarak görev yaptı. 2024 yılında Netflix'te yayınlanan "John Mulaney Presents: Everybody's in LA" adlı talk şovun yapımcılığını ve sunuculuğunu üstlendi.

Ayrıca yetişkinlere yönelik bir animasyon komedisi olan "Big Mouth" dizisinde Andrew Glouberman karakterine sesiyle hayat veren Mulaney,  "Spider-Man: Into the Spider-Verse" (2018) ve "Puss in Boots: The Last Wish" (2022) gibi animasyon filmlerinde de seslendirme yapmıştır. Son dönemde "Bupkis" ve "The Bear" dizilerinde konuk oyuncu olarak yer alan John Mulaney, yine Netflix'te ekranlara gelecek "John Mulaney Presents: Everybody's in LA" dizisi ile yeniden kamera karşısına geçti.