Ankara'da 31 Mayıs 1975 tarihinde dünyaya gelen Defne Kayalar, Bilkent Üniversitesi Güzel Sanatlar, Tasarım ve Mimarlık Fakültesi Grafik Tasarımı Bölümünden mezun olmuş ardından, İstanbul Bilgi Üniversitesi İletişim Fakültesi Radyo Televizyon ve Sinema Bölümünde asistanlık yapmıştır.

2003 yılında Uğur Yücel ile birlikte Alacakaranlık dizisinin yapımcılığını üstlenen Defne Kayalar, 2004’te de Yazı Tura filminin yapımcılığını yapmıştır. 2010 yılında Keskin Bıçak adlı dizide rol almış, 2013 yılında ise 20 Dakika dizisinde kendisine yer bulmuştur. 2014 yılında Medcezir dizisinde sezon sonu konuk oyuncu olarak "Sedef Kaya" karakterini canlandırmıştır ve daha sonra ana karakterlerden biri olmuştur. Medcezir dizisinin yönetmeni Ali Bilgin ile 2014 yılının Aralık ayında evlenmiştir. 2015 yılında ise yönetmenliğini eşi Ali Bilgin'in üstlendiği Delibal filmiyle beyazperdeye geri dönmüştür.

2017’de Bu Şehir Arkandan Gelecek dizisinde yer alan Kayalar, 2021’de oldukça beğeni toplayan Menajerimi Ara dizisinde yer almıştır. İnternet dizilerinde de boy gösteren Kayalar yakın zamanda Fi ve Bir Başkadır dizilerinde kendisinden söz ettirmiştir. Beyazperdede ilk kez 1999’da Salkım Hanımın Taneleri filminde seyirci karşısına çıkan Kayalar, yakın zamanda Aniden filminde canlandırdığı Reyhan karakteri ile seyirci karşısına çıkmıştır.