Robert Mario De Niro Jr., 17 Ağustos 1943 tarihinde New York’ta dünyaya geldi. Ressam Virginia Admiral ile şair, ressam ve heykeltıraş Robert'ın oğlu olarak sanatçı bir ailenin içinde büyümenin ayrıcalığını küçük yaşlardan itibaren hissetti. Çocukluğunun geçtiği Little Italy semtinde ağırlıklı olarak yaşayan İtalyan komşuları, solgun teni ve içine kapanık yapısı nedeniyle onu "Bobby Milk" lakabıyla anıyordu. Zamanının büyük bölümünü kitaplar arasında geçiren bu utangaç çocuk, Broadway sahnelerinde sergilenen oyunların büyüsüne kapılarak ilk sahne deneyimini henüz çocukken bir Oz Büyücüsü temsilinde yaşadı. On altı yaşına geldiğinde okulu bırakma kararı alarak Dramatic Workshop, Luther James Studio ve efsanevi Stella Adler Konservatuvarı’nda oyunculuk eğitimi aldı. Ardından Lee Strasberg’in prestijli Actors Studio okulunda metod oyunculuğunun inceliklerini öğrendi ve burada kariyeri boyunca defalarca aynı seti paylaşacağı Harvey Keitel ile tanıştı. Anton Çehov’un Ayı (L'Ours) oyunuyla ilk kez profesyonel olarak tiyatro sahnesine çıkan oyuncu, sinemadaki ilk görünümünü ise 1965 yılında Marcel Carné imzalı Trois chambres à Manhattan filmindeki küçük bir figüranlıkla yaptı.

Çekimleri 1963’te tamamlanan fakat vizyona 1969’da girebilen The Wedding Party vesilesiyle yönetmen Brian De Palma ile tanışan De Niro, yönetmenin Greetings (1968) ve Hi, Mom! (1970) gibi yarı doğaçlama erken dönem yapımlarında yer aldı. Bu süreci Bloody Mama, Jennifer on My Mind, Born to Win ve The Gang That Couldn’t Shoot Straight gibi mütevazı bütçeli bağımsız filmler izledi. De Niro’nun kariyerindeki asıl kırılma noktası ise 1973 yılında Martin Scorsese ile bir araya gelmesiyle yaşandı. İkilinin ilk ortaklığı olan Arka Sokaklar (Mean Streets) filmindeki gözü kara Johnny Boy karakteri, De Niro’nun müthiş yeteneğini geniş kitlelere tanıtırken sinema tarihine geçecek uzun soluklu bir yönetmen-oyuncu ortaklığının da ilk adımı oldu.

Ertesi yıl Francis Ford Coppola’nın yönettiği Baba 2 (The Godfather Part II, 1974) filminde genç Vito Corleone’ye hayat veren aktör, bu unutulmaz kompozisyonuyla En İyi Yardımcı Erkek Oyuncu dalında ilk Oscar heykelciğini kucakladı. Martin Scorsese ile yol arkadaşlığını Taksi Şoförü (Taxi Driver, 1976) ile perçinleyen De Niro, canlandırdığı Travis Bickle karakteriyle sinema tarihinin en ikonik anti-kahramanlarından birini yarattı. Metod oyunculuğunu kusursuz bir mükemmeliyetçilikle harmanlayan aktör, New York, New York (1977) müzikali için saksafon çalmayı öğrendi; Michael Cimino imzalı Avcı (The Deer Hunter, 1978) öncesinde çelik işçileriyle birlikte yaşadı ve boksör Jake LaMotta’nın yükseliş ve düşüşünü anlatan Kızgın Boğa (Raging Bull, 1980) filmi için yaklaşık otuz kilo alarak gösterdiği fiziksel adanmışlıkla En İyi Erkek Oyuncu Oscar’ını kazandı. İnandırıcılık arayışını Kan Kardeşler (True Confessions, 1981) filmi için Latince ayin yönetmeyi öğrenecek kadar ileriye taşıdı.

Scorsese ile ortaklığını Komedi Kralı (The King of Comedy, 1983), Sıkı Dostlar (Goodfellas, 1990), Korku Burnu (Cape Fear, 1991) ve Casino (1995) gibi başyapıtlarla zirveye taşıyan De Niro, aynı zamanda türler arası zengin bir çeşitliliğe yöneldi. Sergio Leone’nin Bir Zamanlar Amerika (Once Upon a Time in America, 1984) ve Brian De Palma’nın Dokunulmazlar (The Untouchables, 1987) filmleriyle gangster sinemasının vazgeçilmez yüzü olurken; Terry Gilliam’ın distopik klasiği Brazil (1985), Cannes’da Altın Palmiye kazanan epik dram Misyon (The Mission, 1986), karanlık gerilim Şeytan Çıkmazı (Angel Heart, 1987) ve sevilen komedi Geceyarısı Avı (Midnight Run, 1988) ile ustalığını sergiledi. Irwin Winkler’ın Gerçeği Arayış (Guilty by Suspicion) ve Gecenin Kanunu (Night and the City) filmlerinde kamera karşısına geçen aktör, 1993 yılında Günah Tohumu (A Bronx Tale) filmiyle ilk kez yönetmenlik koltuğuna oturdu; bu deneyimi yıllar sonra CIA’in kuruluşunu anlatan Kirli Sırlar (The Good Shepherd, 2006) ile yineledi. Dönemin dev isimleriyle çarpıcı ortaklıklara imza atan De Niro; Kenneth Branagh’ın Frankenstein uyarlamasında yaratığı canlandırdı, Michael Mann klasiği Büyük Hesaplaşma (Heat, 1995) ve yıllar sonra Orijinal Cinayetler (Righteous Kill, 2008) ile Al Pacino’yla sinema tarihine geçen sahnelere imza attı; Güçlüler Bölgesi (Cop Land, 1997) filminde Sylvester Stallone, Başkanın Adamları (Wag the Dog, 1997) filminde Dustin Hoffman ve Komplo (The Score, 2001) yapımında efsanevi Marlon Brando ile karşılıklı oynadı.

1998'de Quentin Tarantino'nun Jackie Brown ve John Frankenheimer'ın Ronin filmlerindeki performanslarının ardından milenyum dönemiyle birlikte popüler komedilere ağırlık vermeye başladı. Anlat Bakalım (Analyze This, 1999) ve devam filmi, Kusursuz (Flawless), Showtime ve dünya çapında gişe rekorları kıran Zor Baba (Meet the Parents) üçlemesiyle geniş kitleleri güldürdü. Bu dönemde 15 Dakika, Ölümcül Komplo (City by the Sea), Tanrıdan Gelen (Godsend) ve Saklambaç (Hide and Seek) gibi vasat gerilimlerde yer alsa da; Köpekbalığı Hikayesi (Shark Tale) ile seslendirme dünyasına, Yıldız Tozu (Stardust) ile fantastik sinemaya uzandı ve N’apcaz Şimdi? (What Just Happened) ile Herkesin Keyfi Yerinde (Everybody's Fine) dramalarında abartısız, duygu yüklü oyunculuğuyla övgü topladı.

2010 yılında Robert Rodriguez imzalı Ustura (Machete) filminde yozlaşmış bir senatörü canlandıran usta aktör, 2011 yılında 64. Cannes Film Festivali jüri başkanlığını üstlenerek Altın Palmiye’yi Terrence Malick’in Hayat Ağacı (The Tree of Life) filmine verdi. Aynı yıl Limit Yok (Limitless), Stone, Killer Elite, Yılbaşı Gecesi (New Year's Eve) ve Baba 2den otuz yedi yıl sonra ilk kez İtalyanca konuştuğu Her Yerde Aşk (Manuale d'amore 3) filmleriyle üretkenliğini sürdürdü. Ardından Being Flynn, Medyum (Red Lights) ve Karanlık Güçler (Freelancers) projelerinde boy gösterdi.

2012 yapımı Umut Işığım (Silver Linings Playbook) filminde Bradley Cooper’ın takıntılı babasını canlandırarak yeniden Oscar adaylığı elde eden De Niro, Luc Besson’ın mafya komedisi Malavita ve Michael Douglas, Morgan Freeman ile Kevin Kline’ı buluşturan Last Vegas (2013) filmleriyle beyazperdede yer aldı. Sylvester Stallone ile boks eldivenlerini yeniden giydiği Hesaplaşma Zamanı (Grudge Match, 2014) sonrasında Otobüs 657 ve Çılgın İhtiyar (Dirty Grandpa) gibi hafif yapımlarla eleştirilse de, The Comedian (2016) filminde Rupert Pupkin esintileri taşıyan stand-up komedyeni rolüyle ustalığını yeniden hatırlattı. Panamalı boksör Roberto Durán’ın biyografisi Demir Yumruk (Hands of Stone) filminde efsanevi antrenör Ray Arcel’e hayat verdi; HBO yapımı Yalanlar Büyücüsü (The Wizard of Lies, 2017) televizyon filminde ise Wall Street tarihinin en büyük dolandırıcısı Bernard Madoff performansı ile beğeni topladı.

2019 yılında Todd Phillips’in Joker filminde Joaquin Phoenix’in karşısındaki televizyon programcısı Murray Franklin rolüyle büyük yankı uyandıran De Niro, aynı yıl Martin Scorsese ile dokuzuncu kez bir araya geldiği The Irishman filminde sendika tetikçisi Frank Sheeran karakterini canlandırarak Al Pacino ve Joe Pesci ile unutulmaz bir sinema şölenine imza attı. Babamla Savaş (The War with Grandpa) ve Şampiyonlar Kulübü (The Comeback Trail) gibi aile komedilerinin ardından 2023 yılında Scorsese ile yeniden buluştuğu Dolunay Katilleri (Killers of the Flower Moon) filminde, 1920'ler Oklahoma'sında Osage yerlilerine yönelik cinayetlerin ardındaki William Hale karakterindeki ürpertici performansıyla Akademi Ödülleri'nde En İyi Yardımcı Erkek Oyuncu dalında bir kez daha aday gösterilerek sinema tarihindeki devasa mirasını taçlandırdı.